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差示扫描量热法如何测量生物分子稳定性

  • 发表时间:2021-11-25
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差示扫描量热法如何测量生物分子稳定性

差示扫描量热法(主要用于表征生物分子(如蛋白质)的稳定性。重要的是,它是对其天然形式的生物分子的直接测量。差示扫描量热法测量可以提供关于热稳定性的数据,并作为结构指纹来评估构象。通过以恒定速率加热分子,测量与生物分子热变性相关的热量变化。差示扫描量热法的优点;由于差示扫描量热法依赖于热测量,因此可以表征天然生物分子,而不必具有光学透明的样品。通过差示扫描量热法测量的特性提供了熔化温度,但也提供了生物分子内折叠和展开力的数据。
 差示扫描量热仪
差示扫描量热法的用途
差示扫描量热法经常用于药物开发。可以使用热量计的一些关键领域包括:生物治疗开发中稳定蛋白质和潜在候选物的选择和表征;配体的相互作用研究;制造和纯化条件的优化;确定液体制剂的条件;了解基本平衡热力学
要了解差示扫描量热法的工作原理及其可为准确生物分子测量提供的好处,了解基本平衡热力学非常重要。本质上,蛋白质和其他生物分子可以在N和D构象之间转移:N–结构化、天然和生物活性构象;D–非结构化、变性和无活性的构象;这种转移是通过温度升高超过特定范围而发生的。该过程不仅限于蛋白质。其他受影响的生物分子包括:有机聚合物;生物大分子,如DNA和脂质;差示扫描量热法中使用的仪器;用于差示扫描量热法测量的关键仪器是热量计。较新的型号,如MalvernMicroCalPEAQ差示扫描量热法,在采样和分析方面提供了许多自动化优势。样品加载后仪器的无人值守操作可以节省操作员的时间,提高工作效率。自动化数据分析可以更快地生成高度可重复的热稳定性数据并符合法规要求。差示扫描量热法仪器使用和协议;正确的使用方法和协议对于确保正确准备仪器和样品以及安全执行实验至关重要。这些协议也记录在美国医学图书馆中。
差示扫描量热仪
启动仪器
通用指南可能因仪器而异。如有疑问,请务必查看仪器手册或联系制造商。打开热量计并增加细胞压力。这可以抑制样品沸腾和防止气泡。在大多数热量计中,使用氮气。根据制造商的指南调整氮气压力。这应该与电池的构成材料一致。将清洁剂储存器加注到正确的体积。保温室温度应设置为正确的值,以在开始实验前保持样品完整性。准备样品;针对作为实验参考的缓冲液透析您的样品。作为替代方案,可以使用在蛋白质纯化的一步收集的洗脱缓冲液。使用凯氏定氮法或洛瑞法确定样品的浓度。使用合适的方法。在单个研究中继续使用相同的方法来保持客观的结果比较。在真空中对样品和缓冲液进行脱气。此处的目的是去除可能导致体积不准确的微气泡。在一些较新的热量计中,这可以跳过。此步骤需要在层流生物安全柜中使用微量移液器和无菌吸头。成对地将样品及其缓冲液装入与热量计兼容的96孔板中。仅用缓冲液填充前两对孔,仅用水填充后两对孔。缓冲液扫描将有助于验证仪器并建立基线。水扫描将清洁细胞。从生物防护柜中取出孔板之前,确保用密封膜正确密封孔板。这有助于防止污染。将板放入仪器的样品保存室时,确保板的方向正确。
差示扫描量热仪
实验设置参数
在软件中输入样品信息。如果可用,也输入浓度。如果没有,请在数据分析前将浓度值输入分析软件。设置清洁选项;根据样品设置实验的起始温度。如果样品未知,请从低温开始。设置实验温度。这取决于样本。选择实验的扫描速率。这也取决于个别实验,但通常为60°C/h、90°C/h或120°C/h。如果您正在扫描未知样品,建议以不同的速率扫描并检查样品内展开的动力学。为了确定热解折叠的可逆性,您应该重新扫描样品。如果第二次扫描的焓至少是第一次扫描的焓值的80%,则展开被认为是可逆的。为了保存热量计中的细胞,实验后将恒温器设置为10°C;在开始实验之前,仔细检查所有参数并确保它们符合实验范围所需的准则。

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